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DNA堿基序列測定

發布時間:2014年01月27日發布人:百力格生物技術關注度:1594

        DNA堿基序列測定即DNA一级结构的测定,目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。双脱氧末端终止法的主要操作步骤有:
 

1.獲得待測DNA片段的單鏈模板
        一般采用基因工程的方法以獲取一定數量的單鏈待測DNA模板。可將待測DNA片段與噬菌體M13DNA進行重組,然後將其導入大腸杆菌進行增殖,M13噬菌體一般以單鏈DNA形式透出細胞再感染新的細菌,故此可獲得單鏈DNA模板。
 

2.合成寡核苷酸引物
        利用DNA合成儀合成一段與待測DNA片段的3’-端互補的寡核苷酸引物。
 

3.模板-引物雜交
        將待測單鏈DNA模板與寡核苷酸引物混合,並進行保溫處理,使引物與DNA單鏈模板的3’-端進行雜交。
 

4.互補鏈的延長和終止
        将上述杂交混合液分为四份,每份混合液中均加入DNA聚合酶,四种dNTPS,一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸(如α- 32P-dATP)。此外还需分别加入一种双脱氧核糖核酸(ddATP,ddGTP,ddCTP或ddTTP)。然后在适当温度条件下延伸互补链,就可得到四组分别以A、G、C、T、终止的长短不一的互补链的混合物。
 

5.電泳分離
        將四組含有長短不等的反應混合物在同一聚丙烯酰胺凝膠板上進行電泳,即可將只相差一個核苷酸的寡核苷酸鏈分離開。
 

6.放射自顯影
        将电泳凝胶进行放射自顯影,即可得到放射自显图谱,通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。

上海百力格生物技術有限公司

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